ワクチンファイル、または、パターンファイルともいう。ウィルス対策ソフトは、このウィルス定義ファイルをもとにウィルスを検出する。
ワクチンソフトはウイルス定義ファイル内に収録された各ウイルスのパターンと検査対象のファイルを照合し、 パターンとの一致が見られるとそのファイルがウイルスに感染していると判断
このため、偶然にもウイルス定義ファイルに収録されているパターンと一致する個所を含むファイルが存在すると、 そのファイルが実際にはウイルスに感染していなくても感染しているものと誤認識してしまうことがある。
次々と現れる新種のウイルスに対応するため、 各ワクチンソフトメーカーは頻繁に自社ソフト向けの新しいウイルス定義ファイルをインターネットなどで配布。
ただし、ウイルス定義ファイルのダウンロードは有償としているメーカーが多く、 これらのメーカーでは一定期間(1年程度)毎にメーカーに料金を支払い、 ダウンロードする権利を取得(あるいは更新)するシステムを取っている。